细胞介绍

AtT-20是一种具有小圆形细胞形态的细胞，它是在1966年从患有肿瘤的小鼠的脑垂体中分离出来的.该细胞系是合适的转染宿主。克隆AtT-20，一种分泌ACTH的细胞系，于1966年10月由G. Sato及其同事从小鼠垂体肿瘤细胞在动物和细胞培养物中交替传代后建立的早期培养物中克隆。(细胞在哈姆氏F10培养基中培养，82.5%；马血清，15%；FBS，2.5%)。小鼠垂体瘤最初是由j .菲尔特等人在LAF1小鼠中建立的。该克隆现在已经在没有交替动物传代的情况下进行培养。检测发现为鼠痘病毒阴性。

细胞特性

1） 来源：小鼠，脑下垂体

2） 形态：小圆形细胞，聚集成簇  悬浮培养

3） 含量：>1x10^6  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)  用途：仅供科研使用。

运输和保存

干冰运输及复苏好存活细胞

（1）1mL冻存管包装干冰运输，收到后-80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

（2）T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。

细胞接收后的处理

1） 收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3） 悬浮细胞：T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm离心5分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。

一．培养基及培养冻存条件准备

1） 准备F12K 培养基 (推荐：iCell-0007)  81.5 %，优质胎牛血清2.5 %，马血清（国产） 15 % (推荐：iCell-002b) ,  P/S 1 %.

传代培养程序:

让细胞团沉淀下来，除去5到10毫升以外的所有培养基。轻轻地将簇转移到新的培养瓶中，并加入新鲜的培养基。通过在摇动平台上孵育来增强增殖。推荐的传代比例为1:2   注意 : 细胞不附着，而是聚集成簇；集群是可行的。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理

1） 冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于该细胞，传代可参考以下方法

让细胞团沉淀下来，除去除5到10毫升以外的所有培养基。轻轻地将簇转移到新的培养瓶中，并加入新鲜的培养基。通过在摇动平台上孵育来增强增殖。推荐的传代比例为1:2   

注意: 细胞不附着，而是聚集成簇；集群是可行的。

悬浮状态下生长的细胞，可以通过向培养瓶中添加完全培养基来维持细胞的生长状态，一般情况下细胞密度维持在1×105~1×106个/mL（不同细胞对密度要求不同，）可以维持细胞的正常生长。添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2的比例进行。

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×10^7个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10^6~1×10^7个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。