近年来，使用腺相关病毒（AAV）载体进行体内基因转移的临床试验数量稳步增加。出色的安全性，以及广泛靶组织的高效转导，使AAV载体成为体内基因治疗的首选平台。即便安全性高，但也不代表AAV没有任何的毒性作用，尤其是肝脏毒性。

肝脏是人体重要的代谢器官，而AAV具有较为强烈的噬肝性，尤其是高剂量的AAV会导致大量的病毒颗粒在肝脏聚集及表达，这可能会导致临床问题，以及动物实验数据不准确，那么如何解决这个问题呢？

脊髓性肌萎缩症（SMA）是一种常染色体隐性、儿童期发病的运动神经元疾病。SMA的起因是SMN1突变或缺失，这种蛋白质的缺乏与运动神经元死亡直接相关，导致肌肉控制、力量和功能的逐渐丧失，从而导致吞咽和呼吸困难，最终个体死亡。Onasemnogene abeparvovec（OA）是单剂量静脉内基因疗法，通过AAV9递送SMN1解决SMA的单基因疾病。然而，它会引起免疫反应，导致肝脏产生的酶增加。

基因治疗先驱James M. Wilson指出高剂量的AAV有潜在毒性¹，一名患有肝酶缺乏症的患者，18岁的Jesse Gelsinger在接受基因治疗四天后死亡。Gelsinger在试验中接受了最高剂量，3.8x10¹⁵个病毒颗粒。高剂量的AAV载体导致对宿主的两种独立影响：对肝细胞的直接损伤，以及全身炎症和相关的凝血病的激活。

miR-122是肝脏特异性表达的miRNA，肖²等人将其5个拷贝的靶序列miR-122T插入许多AAV载体的3′非翻译区（UTR）中，可以有效降低静脉注射AAV对肝脏的损伤：

将AAV9-CB-Luc-5xmiR-122T载体和不含miR-122T的对照AAV9-CB-Luc通过尾静脉注射以1×10¹²的剂量递送到6周龄的小鼠中，三周后处死，分析骨骼肌、心肌和肝脏的荧光素酶活性：

结果显示，带有miR-122T的组比对照在肝脏表达降低了50倍。为了进一步评估miR-122T对降低肝脏转基因表达的影响，作者利用心肌特异性启动子en-MHC-TNT和报告基因LacZ进行了小鼠实验，将组织冷冻切片并进行X-gal染色。注射含有 miR-122T的载体的小鼠肝脏中 LacZ 表达量降低了约 70 倍：

虽然AAV对肝脏毒性不全部由基因在肝脏的表达引起的，一部分是肝脏处的免疫细胞识别到病毒进而引发免疫反应，但后者很难优化，而一些应用性的实验表明，只阻断外源基因在肝脏的非必要表达能够大大降低肝脏毒性。

Benjamin³等人开发了一种全新的、静脉递送、针对中枢神经系统内皮的外壳——AAV-BI30，在相对较低的全身剂量下，该AAV病毒能够有效转导成年C57BL/6小鼠的大脑，视网膜和脊髓脉管系统中的大部分动脉，毛细血管和静脉内皮细胞。

作者从病毒注射后开始，每24小时称重小鼠，连续20天，在给药后一周，低剂量1×10¹¹的AAV呈现出了不良反应，表现为体重减轻、嗜睡行为，在测试的最高剂量1x10¹²下死亡。尸检显示肝细胞转导强烈，伴有异常的核形态（图C）。作者随即插入三个重复的miR-122T，防止了体重的异常变化，维持住了小鼠较优的状态（图D）：

且有效地抑制了NLS-GFP转基因的肝细胞表达，且不影响对中枢神经系统脉管系统的转导：

脂肪组织在能量和代谢稳态中起着关键作用， 但是，当前技术来调节体内脂肪功能具有挑战性。作者构建了含有巨细胞病毒启动子调控报告基因的AAV载体，使用脂联素启动子/增强子元件和肝脏特异性mir-122T靶位点，限制了报告基因对脂肪组织的表达（Scr为无义对照序列，Mir为mir-122T）。作为疗效证明，将瘦素基因掺入脂肪靶向表达载体中，包装到AAV2/8中，并静脉内给药9至10周龄的小鼠。在8周内测量表型变化。瘦素mRNA和蛋白质在脂肪中表达，瘦素蛋白分泌到血浆中。小鼠的反应是逆转体重增加，降低高胰岛素血症和改善葡萄糖耐量。

在该系统中，串联的mir-122T极大减少了病毒在肝脏的表达，且不影响瘦素对于小鼠表型的改变。

总之，AAV并不像人们想象的那么安全，尤其在高剂量使用场景下。通过优化外壳，努力提升AAV对靶细胞的噬性，降低非目的细胞的感染，从而减少剂量是临床以及动物实验努力的方向；此外，通过特异性启动子更大限定AAV在靶细胞的表达也是其优化点之一。在当前基于动物实验的AAV，若部分实验注射之后，出现小鼠死亡、体重异常变化、状态不佳等情况时，可以考虑到肝脏毒性，则可以通过上述方式，在目的基因之后插入mir-122T解除该副作用。吉凯基因长期为客户提供前沿、新颖的病毒使用策略，有兴趣的老师快来咨询吧！！！

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【参考文献】

1.Hepatotoxicity following administration of onasemnogene abeparvovec (AVXS-101) for the treatment of spinal muscular atrophy

2.Liver-specific microRNA-122 target sequences incorporated in AAV vectors efficiently inhibits transgene expression in the liver

3.A High-Efficiency AAV for Endothelial Cell Transduction Throughout the Central Nervous System

4.Targeting adipose tissue via systemic gene therapy