ELISA实验灵敏度高，特异性强，仪器单一，在生物科研上得到了广泛的认可。但在实验中，若不注意实验操作过程中的各个环节，可能会对最终实验结果产生比较大的影响，比如显色弱灵敏度低、背景高、白板等现象。联科生物对以上实验现象进行一一解析及解决方案。这章节讨论背景深（通常ELISA背景OD值<0.2），整板有颜色，可能的原因及解决方法：
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序号
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可能原因
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解决方法
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1
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ELISA板子不正确的贮存
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酶标板贮存于2-8 ℃；使用结合力低点的ELISA板。
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2
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没有正确封闭
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在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间。
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3
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不正确的孵育时间，温度（尤其是底物孵育的时间）
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最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～ 8℃。完全按照说明书要求。
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4
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偶联抗体（streptavidin-HRP）浓度过高
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按照说明书调整到最佳的浓度。
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5
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洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留
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洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。
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6
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底物污染，未避光保存，出现颜色
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弃去底物，重新配置。
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7
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样品稀释液污染
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弃去稀释液，重新配置。
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8
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吸头重复使用，未洗净或消毒不彻底
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吸头尽可能一次性使用。
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9
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样本溶血严重
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建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。
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综上所述：在ELISA实验中应注意以下问题：
► 在实验前应该按相关要求将实验试剂平衡至室温；
► 样本不要溶血，不要反复冻融；
► 各试剂在使用前应充分混匀，以保证试剂的均一性和准确性；
► 严格控制反应温度和反应试剂；
► 相关浓缩液应按说明书要求稀释到相应比例方可使用；
► 洗板次数，洗板液的量，洗板液浸泡时间的长短，按说明书操作；
► 在终止反应时尽量避免微孔中存有气泡；
► 终止反应完成后应该在2min内完成酶标仪读数。