关键词：磷酸化蛋白质组、蛋白质组、II型糖尿病、胰岛β细胞

原文：

Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2019.02.012

不知大家还记得否？去年小编曾报道了一篇Science的重磅文章，由来自德国马普生物化学研究所Matthias Mann团队，利用磷酸化组发现了阿片类药物副作用机制（最新Science重磅：磷酸化组学揭秘阿片类药物副作用潜在机制）。

仅过半年多时间，该研究团队马不停蹄地又发表了一篇力作。最近，该团队在Cell Metabolism期刊上发表了题为“Phosphoproteomics Reveals the GSK3-PDX1 Axis as a Key Pathogenic Signaling Node in Diabetic Islets”的研究，通过磷酸化蛋白质组、蛋白质组学技术，揭示GSK3-PDX1轴是胰岛糖尿病致病关键信号节点。

可见，磷酸化修饰组已成为寻找医药研究领域机制探索的重要技术手段。

研究背景

糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一组以长期高血糖为主要特征的代谢综合征,伴随很多合并症和并发症，其中90%是2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)。2型糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，其发病机理为胰岛素抵抗为主伴有胰岛素分泌缺陷，或胰岛素分泌缺陷为主伴胰岛素抵抗和肝脏葡萄糖产生增加。

越来越多的研究表明，胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病发病的中心环节。然而目前胰岛β细胞功能紊乱具体分子机制仍不完全清楚。因此，系统性了解β细胞功能紊乱机制将有助于对于糖尿病的治疗和预防。

此前，利用转录组、蛋白组研究2型糖尿病发病机制已有诸多报道，但是从磷酸化角度发现关键调控信号通路的报道却不多。磷酸化是调控胰岛分泌重要机制，因此，从整体磷酸化水平研究胰岛素分泌的调节机制有着十分重要的意义。

研究材料

正常小鼠（C57BLKS-Leprdb/+）和糖尿病小鼠（C57BLKS-Leprdb）胰岛组织；

研究结果

01、磷酸化组、蛋白质组

分析正常、糖尿病小鼠模型的蛋白修饰变化

研究人员首先对正常小鼠和糖尿病小鼠的胰岛开展了label free蛋白质组和磷酸化蛋白质组学的分析。结果共定量到6552个蛋白，超过14000个不同的磷酸化位点。

蛋白质组和磷酸化蛋白质组的PCA分析显示，根据其不同糖尿病状态明显的将胰岛分为两群（图1B、C）。在糖尿病组（db/db小鼠）中，上调表达的蛋白质显著富集于炎症过程，而参与胰岛素分泌的关键蛋白质显著下调表达（图1D、E）。此外，db/db组几乎所有mTOR/S6K底物磷酸化水平增加。

图1. 研究技术路线

02、组学生信分析

发现糖尿病小鼠胰岛中信号通路重构

为了探讨调控磷酸化蛋白质组水平变化的机制，作者对db/db胰岛中显著变化的激酶底物motif进行分析（图2A）。结果显示，与高营养素诱导mTOR激活一致，p70S6K底物motif显著富集，而AMPK motif下调表达。其他激酶motif，如ERK1/2和AKT同样下调表达（图2B）。此外，调节胰岛素分泌包括PKA、PKC和CaMK几种主要激酶的motif下调表达，该结果表明胰岛β细胞在高葡萄糖诱导后不能正常分泌胰岛素。

作者进一步想了解在胰岛细胞缺陷条件下信号通路如何整体重新布局。db/db胰岛中PKA和PKC底物发生显著的去磷酸化， 其催化底物的表达水平减少（图2C）。糖尿病胰岛中，高营养水平诱导mTOR通路激活，进而通过p70S6K-IRS1/2负反馈弧导致AKT抑制。AKT活性降低进而引起其直接作用底物磷酸化水平的降低，GSK-3β是AKT的重要底物，其活性受AKT的负调节。结果显示，在db/db胰岛中，GSK-3β的Ser9磷酸化抑制，同样地GSK-3β 的Tyr216的酪氨酸磷酸化水平显著上调，该结果进一步证实GSK-3β在糖尿病胰岛中活性增加。PDX1 的是GSK3 β 和HIPK2直接作用底物，后者通过磷酸化Ser269可引起该蛋白进行蛋白酶体降解。结果显示，糖尿病胰岛中，PDX1的Ser269的磷酸化水平上升，蛋白水平受影响，而其mRNA水平不受影响。结合文献和本实验数据表明，在糖尿病胰岛中信号传导轴从mTOR通路激活开始，通过mTOR激活GSK3β，PDX1降解。

图2. db/db小鼠胰岛中的关键信号通路被调节

03、挖掘致病关键信号轴

db/db胰岛中PDX1（胰腺十二指肠同源框蛋白1）抑制使得GLUT2（葡萄糖转运子）下调表达以及抑制β细胞糖酵解

研究发现在糖尿病组的胰岛中GSK-3β 激活，导致PDX1降解，这也确定了PDX1在β细胞生理学中的重要性。那么在β细胞中PDX1下游靶标的表达是否同样受到影响？结果显示，与对照组相比，db/db胰岛中所有PDX1的靶标都显著下调表达，其中GLUT2蛋白下调表达程度最大(图3A)。GLUT2作为一种葡萄糖感受器，能够有效调节血糖浓度，密切参与葡萄糖诱导的胰岛素分泌。

此外，糖尿病胰岛中参与糖酵解和TCA循环途径的关键酶显著下调表达，该变化从整体上影响了葡萄糖代谢（图3B）。此外，研究还发现几乎所有呼吸酶的底物的表达水平均显著下调，降低的糖酵解代谢导致ATP/ADP浓度比降低，进而可负反馈影响下游胰岛素分泌机制。而对蛋白质组学数据的分析也表明许多参与胰岛素细胞外分泌的蛋白显著下调表达。

图3. GLUT2抑制与糖酵解抑制相关

04、磷酸化组、蛋白质组在人胰岛中验证信号轴功能

糖毒性触发GSK3依赖PDX1下调表达

在糖尿病过程中，不同的因素协同作用引起β细胞丢失和功能障碍。慢性或周期性暴露β细胞会导致葡萄糖和脂质或干扰β细胞功能促炎细胞因子水平提高。此外也有研究报道，GSK-3β可调控葡萄糖体内平衡。实验结果也揭示了GSK-3β活化导致PDX1抑制，进而导致糖尿病胰岛中胰岛素分泌机制损伤。因此，作者进一步研究糖毒性是否可独立触发β细胞中GSK-3β激活，继而导致PDX1转录因子及其下游靶标的降解。作者对三个不同志愿者胰岛和INS1e大鼠β细胞分别给予高葡萄糖处理，随后对其进行蛋白质组和磷酸化蛋白质组学分析（图4A）。结果显示，在响应慢性葡萄糖水平上升的过程中，一共约有7000个蛋白和19000磷酸化位点发生变化。

为了探讨PI3K-AKT-GSK3以及其他关键信号通路激活状态，通过组学数据以及结合文献报道的信号通路。结果发现，在人胰岛和大鼠β细胞中，慢性高血糖症导致GSK3激活。同时还发现随后GSK3的靶标磷酸化水平提高，PDX1 的Ser268磷酸化水平上升，导致其降解（图4B）。PDX1靶标的表达水平，包括GLUT2和INS在db/db胰岛中均下调表达（图4C）。

后续作者进一步验证GSK3在调控PDX1稳定性及其转录靶标GLUT2关键作用。首先，作者通过单独或使用蛋白酶体抑制剂MG132, 通过抑制PI3K激活GSK3处理人胰岛。结果发现，GSK3激活有效的导致PDX1降解和GLUT2抑制。更重要的是，GSK3激活的同时影响了葡萄糖诱导胰岛素的分泌。那么抑制GSK3是否可改善糖尿病症状。作者通过使用GSK3抑制剂LY2090314处理肥胖小鼠，结果发现，该处理不仅恢复GLUT2和PDX1表达，同时完全恢复胰岛分泌胰岛素能力（图4）。

图4. 糖毒性诱导GSK3依赖PDX1下调表达

05、结论

作者通过基于质谱的高通量磷酸化蛋白组、蛋白质组学技术，结合生物信息分析，深入比较了正常和糖尿病小鼠胰岛的磷酸化蛋白质组和蛋白质组信号网络图。 最终结果发现，GSK3是胰岛素分泌的关键调节节点，抑制GSK3能恢复了糖尿病胰岛分泌胰岛素的能力。

小编总结

糖尿病是一类非常常见的代谢性疾病。虽然此前，关于糖尿病有大量组学报道的，包括利用转录组学以及蛋白质组学来研究不同2型糖尿病动物模型或人胰岛，但是，这些研究主要是从参与β细胞损伤的差异基因或差异蛋白的角度进行分析，但大规模分析该疾病的磷酸化信号网络变化的研究却甚少。

正是利用了更为新颖的修饰组学进行研究，该文为我们呈现了一幅细致的糖尿病磷酸化网络水平关键信号通路变化图，并最终发现了胰岛素分泌的关键调节信号轴。因此，对于一些利用转录组等常规组学做的较为深入的疾病而言。我们不妨从更为新颖的修饰组学入手，去挖掘一些新的疾病致病机制。

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