ELISA实验加入显色底物后，标准品有颜色，但结果分析发现标准品最高点吸光值偏低或偏高、标准曲线无梯度等等，总结如下原因：
1、 标准曲线最高点吸光值偏高，超出仪器检测范围
ELISA标准曲线最高点的吸光值一般在3.0以下，若太高超出仪器检测范围，显示OVER FLOW，可能原因：
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序号
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可能原因
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解决方法
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|---|---|---|
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1
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如OD绝对值靠谱，
则显色过度
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TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，
当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。 |
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2
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仅作单波长检测
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由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等，
对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。 |
ELISA标准曲线最高点的吸光值一般要在0.8以上，若小于0.8，可能的原因：
| 序号 |
可能原因
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解决方法
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|---|---|---|
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1
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粉末标准品
未充分溶解
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粉末标准品按说明书加一定体积的液体后，
轻柔混匀， 室温静置30分钟，充分溶解。
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2
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标准品反复冻融
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标准品反复冻融后活性降低。
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3
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孵育温度、时间
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按说明书要求孵育条件进行孵育。
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4
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显色时间控制
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TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，
当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。
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ELISA 实验中标准品2倍倍比稀释，但结果分析标准曲线没有梯度，可能的原因：
| 序号 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 1 | 样品或标准品污染 | 避免污染 |
| 2 | 错误的样品或标准品的稀释 | 完全按照说明书稀释 |
| 3 | 偶联抗体浓度过高 | 按照说明书调整到最佳的浓度 |
| 4 | TMB底物孵育时间过长 | 调整到合适的孵育时间 |
| 5 | 错误的孵育时间或温度 | 完全按照说明书 |
| 6 | 孵育时未加盖导致溶液挥发和污染 | 贴封片或加盖 |
总结得到完美ELISA标准曲线，需要注意几点：
1、 充分溶解标准品；
2、 标准品避免反复冻融；
3、 梯度稀释标准品注意混匀。
联科生物推荐：ELISA操作注意事项—标准品溶解稀释。