ELISA检测的干扰因素与方法

ELISA应用最广，但这种固相测定技术非完美无缺，把握实验过程中每一个可能出现差错的关键性问题，采取相应的举措，才有可能使实验性误（漏）诊减少到最低限度。

1. 表面效应

首先必须明确指出的是，：“固相”ELISA与传统的“液相”血清学试验的最大.最本质的区别是有一个预先固相抗原或抗体到载体表面的步骤，以及抗原与抗体结合反应由液态环境移

到了固相载体表面进行。蛋白质分子在吸附过程中，为了克服与固相载体之间的排斥力，需要重新分布其表面的功能性基因，使疏水性基因充分暴露，然后，局部接触区域的偶极分子脱氢，再通过范德瓦尔斯力吸引而固相到载体表面。 表面效应可直接影响抗原，抗体的构象和功能。此外，表面效应亦影响抗原和抗体结合反应的动力学过程。

(1) 固相导致抗原的变化 为了测定抗体水平，需预先将抗原固相（包被）到极性和

水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）酶标板上。用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等，导致的变化是多方面的，可引起分子构象和抗原性发生改变。酶活性测定时可消失。牛血清白蛋白固相之后，其抗原价可由5价降为1价。此外，发现被动吸附方法固相铁蛋白，呈团串状，不均一的 随机分布，这种影响质控的情况具有普遍性。最后，大多数小分子半抗原不易直接吸附到载体表面。解决这一难题的方法，一般是采用在小分子 抗原上，先偶联上葡聚糖，明胶等手臂后再进行固相包被。对于有多重表达抗原决定簇的大分子抗原，用抗体桥式包被法可避免表面效应的影响。将蛋白抗原吸附于胶体AI(OH)3后再固相也可以避免蛋白变性。用Y射线辐照（400GY）PS板，不但可增加蛋白抗原吸附能力，而且还有降低抗体测定本底的作用。

(2) 固相对抗体的影响 直接吸附固相抗体（Igs）分子，除了呈团串状，不均分布和易解吸等一般不利因素之外，Igs分子摊开在载体表面，不但构象发生改变，而且影响抗体的活性，如IgG的结合价减少，可由2价变为1价，甚至完全失活。实验结果表明，单克隆抗体比多克隆抗体更易失活，固相后仍能保持结合能力的分子仅占少数，分别为3%和5%-10%。这不但浪费抗体试剂，更可惜的是空置了有限的微孔表面积。抗体分子N末端为Fab，C末端为Fc，直接被动吸附的随意性，造成一部分Fab，C末端为Fc，直接被动吸附的随意性，造成一部分Fab结合位点朝向载体一面，或因用量过多而造成的重叠吸附，部分Fab结合位被遮盖，均可导致其总体结合能力下降。为此，出现了可以“锚定”F.段在载体表面，而使Fab朝外的共价结合法，即在载体上导入氨基 肼基等活性基因，然后在水溶性碳二胺作用下，与Igs的羧基共价结合，或直接与羟基化糖基产生的醛基共价结合：含溴乙烯基团的PS板，可在双功能交联剂如戊二醛的帮助下与蛋白质共价结合。目前，国外已有有关的酶标板产品（**）供应。

桥式法是一种避免Igs与载体直接接触的固相方法，有几种不同的类型：（1）抗抗体法：（2）SPA法：（3）链酶亲和素生物素法，这一种方法应用 最为成功，只要预先将第一捕捉抗体生物素化：（4）抗半抗原抗体法，这需要将捕捉体预先记半抗原。

（3）抗体介导的抗原分子变构 抗原与抗体分子在三维立体空间自由运动，互相碰撞，彼此特异性结合，这种结合不似早期相像中的单纯的“锁-匙”关系，而是一种柔性的诱导契合。抗原分子决定簇可以突入到Fab的深底部，反过来，Fab为了执行其固有生物学功能，主动地发生变角折弯，锥形转动及最N末端可变区的“球穴”摆动，以契合抗原决定簇，Fab亦可突入到大分子抗原的较深的位区。液态中的抗原体分子在完成一级结合反应之后，该复合物可以通过抗原抗体之间的特异性结合，亦可通过抗体Fc-Fc段的非特异性结合而进一步交联，形成肉眼可见的晶格形网络沉淀凝集型的抗原抗体二级反应复合物。纵观全过程，抗原分子一般总能保持其固有的构象，而复合物中的抗体构象变化则较大。相反，在固相抗体测定抗原的过程中，由于表面效应的关系，抗体介导的抗原分子变构具有特殊意义。

2. HD-HOOK效应

这种发生在固相法试验过程中的可造成“假低值”甚至“假阴性”错误结果的特殊效应，称为“高剂量钩镰(HD-HOOK)效应”。它的产生条件、分子基础、导致的后果等，都与传统的液相沉淀、凝集反应中的“区带现象”不一样。在一步二位点夹心ELISA中，主要是因为待测抗原的总量过高，竞争结合反应系统中的限量标记二抗，从而产生抗原越多，最终反应信号越低的HD-HOOK效应，如HBsAg等可出现假阴性。抗原“量”是决定的因素，一般认为二步二位点夹心固相测定法不会产生抗原过剩的“阴滞现象”之观点，早已被Miles的实践否定，只是并非所有二步夹心法都会产生HD-HOOK效应。迄今为止，仅少数具有多重抗原决定簇的大分子蛋白质抗原，如铁蛋白、前列腺特异抗原（PSA）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）、甲胎蛋白(Afp)、细胞溶素-D等，本身具有分子变构内因的抗原，测定时发现了HD-HOOK效应。抗原“质”的特性是决定的因素，而标记二抗介导抗原分子变构是重要的外因。当然抗原的数量亦是必备的相关因素。以铁蛋白为例，被捕捉的铁蛋白抗原分子，与亲和性比一抗大的标记二抗发生交叉重叠结合后，由于立体效应，可促使铁蛋白分子变构，使其与一抗解离，形成标记二抗与铁蛋白分子复合物，而被随后的洗涤过程洗离出去，最终的信号下降。在剂量反应曲线的高剂量（HD）区段，其线型走向不是呈平台状无限后延，而呈向下弯落状，似一只钩或一把镰刀(HOOK).若单纯从剂量反应曲线的钩状图形来看，与区带现象中抗原过剩型复合物的“后带现象”十分相似。然而，其分子基础完全不同，“晶格理论”仅能解释区带现象，而对固相二步夹心ELISA的HD-HOOK效应的解释，目前认为，“抗原分子变构理论”比较贴切。

克服HD-HOOK效应，主要依靠试剂盒的生产厂家。首先，对靶抗原的决定簇应尽可能弄清楚，在此基础上，选择仅有一种而且仅有两个重复表达的决定簇，或者两种且每种仅有一个表达的决定簇，选用相应的一个单抗，或者两个相应单抗来组建药盒，有可能从根本上解决HD-HOOK效应的弊端。作为应用者，可用稀释测定法解决这一问题。 在测定未知标本的aFP值时候，用原标本与10倍稀释的标本同时测定，发现原倍孔A值低于稀释孔，证实了HD-HOOK的存在，从而避免了实验的误（漏）诊。

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