文献解读
过继性细胞疗法(Adoptive cell therapy)是通过复杂的离体培养和细胞工程方法获得过继性T细胞，在体外进行培养增殖，并特异性识别肿瘤细胞，而后将具有抗肿瘤反应性的细胞大量的扩增后回输到癌症患者体内。白细胞介素-2(IL-2)是大多数ACT治疗方案的组成部分，不过其半衰期很短，只有几分钟，且治疗窗口很小，毒性副作用很大，因此过去使用IL-2治疗的患者必须住院24小时密切观察，稍有不慎就有生命危险。因此，巨大的副作用限制了其在临床的广泛应用。
NKTR-214为何方神圣？
为了克服IL-2副作用的难题，尝试利用IL-2途径的有益作用，同时限制其毒性，以提高治疗潜力，科学家们想尽了各种办法。最终在正常的IL-2分子上面加上了6个聚乙二醇(PEG)进行修饰，形成暂时没有活性的药物，但是在患者中注射了NKTR-214后，加上的6个PEG会逐渐脱落，形成了有活性的2-PEG和1-PEG的形式。其作用机制主要假说：NKTR-214可以比IL-2更好地增强T细胞的扩增能力、激活T细胞能力以及延长T细胞发挥作用的持久力来增强T细胞的抗肿瘤作用。
研究思路
为验证这一假说，加州大学Parisi等研究者们从基因组和蛋白组等多方面着手，对NKTR-214+ACT vs IL-2+ACT两种处理进行了研究对比，揭示NKTR-214抗肿瘤效应的作用机制。
在小鼠黑色素瘤模型中，通过肿瘤消退情况，比较两种处理不同的抗肿瘤效应；
在小鼠黑色素瘤模型中，比较两种处理对CD8 T细胞增殖能力的影响；
RNA-seq在基因组层面揭示免疫相关基因的表达变化；
IsoLight单细胞功能蛋白组学技术在蛋白组层面揭示免疫细胞多功能性的变化。
相关结论
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NKTR-214+ACT具有更好的抗肿瘤效应
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Parisi等借助小鼠黑色素瘤模型，分别采取IL-2+ACT和NKTR-214+ACT两种处理方式，比较肿瘤随时间的消退情况(Fig.1b)以及肿瘤生长延迟情况(Fig.1c)。经过NKTR-214+ACT处理的小鼠，其肿瘤平均体积相同时间内明显小于IL-2+ACT处理组；同时也进行了肿瘤延迟生长研究，即进行ACT两种处理后，单纯ACT处理组11天肿瘤组织即生长到1000mm3，IL-2+ACT处理组19.5天后肿瘤组织即生长到1000mm3，而NKTR-214+ACT处理组42天后肿瘤体积才达到1000mm3，由此可见NKTR-214能显著增强T细胞的抗肿瘤效应，缩短肿瘤消退时间。
Figure 1a. pmel-1 ACT模型的示意图，分别进行IL-2+ACT和NKTR-214+ACT两种处理方式。
Figure 2b.肿瘤平均体积随时间的变化。
Figure 2c.肿瘤生长延迟曲线（生长到1000mm3）。
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NKTR-214大大提高T细胞的扩增能力
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为了更好地了解ACT + NKTR-214治疗提高抗肿瘤活性和T细胞运输的机制，Parisi等对pmel-1 T细胞进行基因修饰，使其表达荧光素酶，进而使用生物发光成像(BLI)在小鼠体内检测T细胞富集情况，以跟踪过继转移T细胞的增殖情况和生物分布，每9天是一个治疗周期，输注1次NKTR-214或IL-2刺激T细胞反应，共进行了3个循环周期。
Figure 2a. ACT+IL-2 和ACT+NKTR-214分别处理5天和14天后，T细胞增殖及分布情况。
Figure 2b. 脾脏体积随时间依赖性曲线 。
Figure 2c. 肿瘤生长延迟曲线（生长到1000mm3）。
NKTR-214处理组脾脏内T细胞在5-7天内显著扩增(2a)，5天时T细胞数量达到顶峰，其荧光强度是IL-2处理组的14倍(2b)，同时也检测了浸润到肿瘤中的T细胞情况(2c)。 NKTR-214治疗增加了脾脏T细胞的扩张和持久的肿瘤浸润性。
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NKTR-214上调免疫相关基因的表达
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为了确定NKTR-214+ACT对肿瘤微环境的影响，Parisi等对第12天采集的肿瘤样本进行了RNA测序(RNA-seq)分析。与IL-2+ACT组相比，NKTR-214组明显上调了干扰素、白介素和趋化因子及其受体基因的相关表达，包括IFN-γ、IL-5、IL-6、IL-15、IL-18和IL-27及相关趋化因子。
Figure 3.RNA-seq：干扰素、白细胞介素及其受体和趋化因子及其受体的基因表达热图。
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NKTR-214增强肿瘤特异性T细胞的多功能性
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为了评估IL-2和NKTR-214小鼠黑色素瘤治疗组中T细胞功能性差异，研究者借助IsoLight单细胞功能蛋白组检测平台，在单细胞水平上分析数千个T细胞，以获得28种细胞因子的分泌频率和强度。
Figure 4a. 单细胞功能蛋白分析IsoCode芯片示意图。
Figure 4b. 单细胞T细胞多功能性PSI及热图。
与IL-2治疗组相比，不论在小鼠脾脏还是肿瘤组织中，NKTR-214组T细胞的多功能性(Polyfunctionality)都大大提升，分别是IL-2组的1.7倍/10倍(Fig.4b)；NKTR-214组脾脏中T细胞多功能指数(PSI)比IL-2组的高达20倍(Fig 4b)，且其多功能性的提升主要依赖于MIP-1α，Granzyme B，IFN-γ的驱动。尤其是在脾脏T细胞中，主要通过提高MIP-1α，IFN-γ，其次Granzyme B，RANTES因子驱动，以及降低肿瘤T细胞中的免疫抑制蛋白TGF-β来实现T细胞多功能性效应。(Fig 4d 4e)
Figure 4c: 单细胞多功能贡献指数：显示个体细胞因子驱动。
Figure 4d: 细胞因子分泌图：揭示单个细胞分泌每个细胞因子的频率。
Figure 4e: 细胞因子信号分布图：显示各细胞因子的单细胞分泌强度。
尽管NKTR-214在动物模型中显示出了很好的结果，仍需要在临床中进行评估，以评估在人类体内的潜在效应。随后，研究者在临床I期实验(NCT02869295)中，输注治疗前后分别采集患者外周血，使用IsoLight单细胞多功能蛋白系统探讨了NKTR-214治疗机制，发现其同样可增强患者血液中免疫细胞的扩增能力及多功能性，达到比IL-2更好的治疗效果。Fig.5可以看到NKTR-214治疗显著提升了患者NK细胞的PSI指数，尤其是在第二次给药后，并且在各多功能细胞亚群中，效应因子和刺激因子均占主导地位，尤其是在CD4和CD8 T细胞中，对多功能指数PSI贡献最大的驱动因素是TNF-α，IFN-γ和IL-5。
Figure 5. NKTR-214治疗的患者PBMC中T细胞和NK细胞多功能性指数。
总结
★ NKTR-214+ACT能够控制大的、免疫原性差的肿瘤的生长，并且与多功能抗肿瘤CD8效应T细胞的高度扩增、肿瘤靶向性和持久性相关。
★ IsoLight单细胞多功能蛋白检测技术证明了NKTR-214促进T细胞、NK细胞肿瘤抗原特异性多功能性，并且该多功能性与I期临床体内抗肿瘤活性相关。
★ IsoLight单细胞多功能蛋白检测平台揭示了NKTR-214促进免疫细胞多功能性的关键驱动因子。
参考资料
Parisi, G., Saco, J.D., Salazar, F.B. et al. Persistence of adoptively transferred T cells with a kinetically engineered IL-2 receptor agonist. Nat Commun 11, 660 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-019-12901-3.
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