上期的蛋白组学FAQ文章推出后老师们积极关注，那么这期再给各位老师整理些经常咨询的问题，以供参考。

Q&A

Q1 : 蛋白组一般是建议做多少个生物学重复？

A: 原则上是生物学重复越多越好，排除个体差异，筛选的差异蛋白更准确，验证成功率更高。考虑到经费、统计分析需要及后续编辑可能会质疑的情况，临床样本建议每组十个重复以上，其他来源样本每组至少三个重复。

Q2 : 蛋白组样本如何寄送？

A: 常规组织、细胞、体液等生物样本需要低温保存，干冰寄送。胶条样本可以冰袋寄送。

Q3 :蛋白组学能否测未知的蛋白？或者是表达的外源蛋白，该样本物种数据库里没有的蛋白能否测到？

A:蛋白组学检测结果是与已知的数据库蛋白进行比对，无法预测未知的蛋白，如果需要检测未知蛋白，可采用测序等其他方法。如果数据库里不包含关注的蛋白，那么无法比对到。可以将关注的蛋白序列加入到数据库里作为搜库文件进行分析。

Q4 :磷酸化蛋白组学实验的流程？

A:磷酸化蛋白组可以做非标记产品，也可以做标记产品。目前标记产品做的较多，可以增加检测深度。实验流程主要是包括样本前处理、蛋白的提取、蛋白浓度的测定和跑胶质控、酶解成肽段、修饰肽段的富集、（肽段标记）、质谱检测。方案多样化，可以进行选择，可以先富集再分级再检测，或者先标记、分级、每级富集等等。

Q5 :蛋白检测结果较少是为什么呢？

A:首先可能是数据库比较小的原因，导致检测到的结果比较少。可以选择扩大层级或者选择研究较多的近缘物种、模式物种数据库进行搜库分析。其次看下胶图，判断样本本身条带是否较少，是否存在高丰度蛋白，高丰度蛋白的存在会影响检测数量。

Q6 : 鉴定到的蛋白与凝胶电泳图谱中估测分子量差异很大的原因？或者为什么SDS-PAGE胶上不同位置条带的质谱鉴定结果中含有同一个蛋白？

A: 由于体内或者体外因素，导致同一蛋白存在不同形式的修饰、剪切或者降解，从而形成凝胶电泳图中能够看到的存在差异分子量的蛋白条带。然而这些蛋白在质谱鉴定时会同时指向数据库中同一个、全长的、无修饰的蛋白理论序列。因此会出现凝胶电泳图中的蛋白分子量（实际分子量）与鉴定的蛋白分子量（理论分子量）不同的情况。

Q7 : 差异蛋白如何筛选？

A: 差异蛋白筛选的条件主要是结合T检验的p值和FC值，一般标记产品按照FC>1.2 or FC<0.83,p<0.05;非标记产品按照FC>1.5 or FC<0.67,p<0.05进行筛选。实际过程中也会结合检测结果进行放宽或者卡严，一般控制在检测结果20%以内，5-10%为佳。

Q8 : 做完蛋白组学，选用何种方法验证呢？

A: 常规蛋白验证方法主要包括WB、ELISA、PRM。如果关注的蛋白数量不多且有对应的商品化检测试剂盒或者抗体，建议选择ELISA或WB方法进行验证，此方法更为成熟。如果关注的蛋白数量较多，也没有商品化的抗体，建议选用PRM的方法。经费充裕的情况下，抗体制备也是一个不错的选择。

Q9 : 通过western blot检测到的蛋白，为什么质谱没有检测到或者只检测到一个肽段？

A: Western blot 检测是将目的蛋白信号放大很多级之后进行检测的，灵敏度很高，（除非特异性结合之外）几乎不受复杂样品中背景蛋白丰度的影响。质谱检测时样品中丰度较高的蛋白优先、多次被检测到，而丰度较低的蛋白则因为肽段信号过弱被淹没而不能被检测到。因此，如果样品中待检测的目标蛋白丰度较低，即使WB能够检测到，质谱并不一定能检测到或者仅能检测到较少的肽段数。

Q10 : 同一批样本，转录组数据下调，但是蛋白组学结果上调，这种是什么情况？

A: 这是正常的现象，上下游不是一一对应的关系，常规mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4~0.5。一个蛋白的表达受到很多因素的控制，除了这个蛋白对应的mRNA之外，还有比如转录因子，增强子，抑制子，DNA和RNA的修饰作用等等。

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