酶标记抗体-HRP标记抗体原理及方法,戊二醛二步法和过碘酸钠法-分析方法-资讯-生物在线

酶标记抗体-HRP标记抗体原理及方法,戊二醛二步法和过碘酸钠法

作者:上海远慕生物科技有限公司 2015-11-23T00:00 (访问量:3955)

酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记 SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否,因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体,它是将酶与特异性抗体经适当方法 连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,其次要有良好的制备方法。目前,高质量的酶(如辣根过氧化物酶,简称 HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上,宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方 法。

(一)酶制剂及其底物

凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶, 原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求:
(1)来源方便,易于纯化;
(2)比活性高,性质稳定;
(3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷 酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以最常用。HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色 的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量 18% HRP 由多个同功酶组成,分子量为 40,000, 等电点为PH3~9,酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。酶 溶于水和58% 以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275 nm,一般以 OD403nm /OD275 nm 的比值 RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的纯度。高纯度的酶 RZ 值应在 3.0 左右(最高可达3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,纯度并不表示酶活性,如当酶变 性后,RZ值仍可不变。HRP 的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。
酶促反应的过程如下:
HRP
DH2+H2O2────→D+2 H2O

供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。如DAB(3.3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。 5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿 色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是:OPD(邻苯二胺)和 TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度上据报道后者 比前者可高 4 倍以上。另外,还有一种供氢体称 ABTS[2,2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方 面,ABTS 与 TMB皆是 值得被优选的供氢体。

由于 HRP 的底物 H2O2 本身又是酶的抑制剂,因此酶促反应中使用的 H2O2 不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰(说明H2O2 已消耗殆尽)。这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。

(二)HRP标记抗体的方法

酶与抗体交联的方法有许多种, 根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备 HRP 结合物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

戊二醛二步法

1. 原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

2. 标记步骤:
(1)称取 HRP25 mg 溶于 1.25% 戊二醛溶液中,于室温静置过夜。
(2)反应后的酶溶液经 Sephadex G-25 层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在 1 ml/1 分钟,收集棕色流出液。如体积大于 5ml,则以 PEG 浓缩至 5 ml。放置25 ml 小烧杯中,缓慢搅拌。
(3)将待标记的抗体 12.5 mg 用生理盐水稀释至 5 ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用 1M PH9.5 碳酸缓冲液 0.25 ml,继续搅拌 3 小时。
(5)加 0.2M 赖氨酸 0.25 ml,混匀后,置室温 2 小时。
(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置 4℃ 1 小时。
(7)3000 rpm 离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀物溶于少量 0.15 M PH7.4 的 PBS 中。
(8)将上述溶液装入透析袋中,对 0.15 M PH7.4 的 PB 缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000 rpm离心30 分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。

3. 结果判定:
(1)定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定 其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定(见本节(三)工作浓度的选择)。
(2)定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程 1 cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
IgG 量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62酶量(mg/ml)IgG 量(mg/ml)酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 440,000 160,000IgG量(3)本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2~4% 的酶与蛋白质结合。

4. 试剂及器材:
(1)0.1 M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS):取0.2M Na2 HPO4 49 ml, 0.2M NaH2PO4 51 ml,NaCl1.8 克,加蒸馏水至 200 ml。
(2)1.25% 戊二醛液:取 25% 戊二醛50 ml与PH6.8的PBS1 ml 混合。
(3)1M PH9.5 碳酸盐缓冲液:取 1M 碳酸钠3 ml 与 1M 碳酸氢钠7 ml 混合。
(4)0.2M 赖氨酸溶液:称赖氨酸 29.2 mg 溶于0.01M PH 9.5碳酸缓冲液 1 ml 中。
(5)0.15M PH7.4 PBS 及生理盐水。
(6)PH7.8 饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG,MW2000)。
(8)纯化的特异性抗体或抗 Ig 抗体。
(9)HRP(RZ>3.0)。
(10)Sephadex G-25层析柱(2 cm×50 cm)。
(11)搅拌器,分光光度计,离心机。
(12)透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。

简易过碘酸钠法

本法是以 NaIO4 先将 HRP 表面的糖分子氧化成醛基,然后再与 Ig 上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近 70% 的 HRP和 Ig 结合,99% 的 Ig 与酶结合,酶与 Ig 的活性无重大损失,是目前最常用的方法。

1. 原理:经典的过碘酸钠法中需采用二**氟苯封闭 HRP 上残留的 α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wilson 等改用在低PH 下使 NaIO4 氧化 HRP,从而省去了二**氟苯封闭 HRP 步骤。HRP 经 NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用 NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。

2. 标记步骤:
(1)称取 5 mgHRP 溶解于 1 ml 蒸馏水中。
(2)于上液中加入 0.2 ml 新配的 0.1M NaIO4 溶液,室温下避光搅拌 20 分钟。
(3)将上述溶液装入透析袋中,对 1 mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析,4℃ 过夜。
(4)加 20μl 0.2M PH9.5 碳酸盐缓冲液,使以上醛化桯 RP的PH 升高到 9.0~9.5,然后立即加入 10 mgIgG(抗体,或 SPA5 mg)在 1 ml 0.01M 碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌 2 小时。
(5)加 0.1 ml 新配的 4 mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2 小时。
(6)将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS 透析,4℃ 过夜。其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。

3. 结果判定:
除标记物 IgG 量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.624. 试剂及器材:
(1)0.1M NaIO4:称取241 mg 高碘酸钠(广州化学试剂厂,批号 830602)溶于蒸馏水 10 ml中。
(2)1 mM PH4.4 醋酸钠缓冲液:
0.2M NaAc(1.361 克/50 ml)3.7 ml
0.2M HAc(0.601 ml/50 ml)6.3 ml 加蒸馏水至2,000 ml.
(3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:
Na2CO3 0.32 克
NaHCO3 0.586 克
加蒸馏水至50 ml
再用蒸馏水作 20 倍稀释,即成 0.01M PH9.5 的碳酸盐缓冲液。
(4)NaBH4溶液(4 mg/ml):
临用时称取 NaBH44 mg溶于1 ml 蒸馏水中。
(5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。

(三)工作浓度的选择

在免疫酶技术中,首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化,便可导致试验结果产生很大的波动。另外,由于浓度过高,可使 非特异性反应增加,而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此,正式试验前必须准确滴定其工作浓度。酶标记抗体的滴定方法是:将抗原(或抗体)物理吸附于固相 载体上,然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应,以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价,或称 工 作浓度。

其步骤为:先将抗原(或抗体)用 0.05M PH9.6 包被缓冲液稀释为 10 μg/ml 左右,于聚苯乙烯板孔内加0.1 ml,4℃过夜,次日以洗涤缓冲液洗涤 3 次。酶标记抗体用1%BSA-PBS 液 依次稀释成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600??(根据据抗体的滴度而定),分别加入反应孔中,每个稀释度二孔,每孔 0.1ml,37℃ 孵育 1小时后洗涤。然后加底物液,每孔 0.1 ml,37℃10~30分钟。以 2M H2SO4 0.05 ml终止反应。结果判定主要以 ELISA 比色仪读取各孔 OD 值。并以OD 为纵座标,结合物浓度为横座标,绘制滴定曲线。由曲线上查得 OD 值为 1.0左右,且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度,即为该标记物的工作浓度。

有关试验的试剂及器材均见 ELISA 部分。

要说明的是,本法为 ELISA 直接法,所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立 ELISA 实验系统中,因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法),以达到最适的实验条件。

(四)注意事项

1. 在具备高质量 HRP 的条件下,所要标记的抗体也要活性高, 效价高(最低 1∶16), 纯度高,亲和力好,这是保证标记物效价高,免疫活性好的首要条件。

2. 所使用试剂的PH 和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂,最好(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品,因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则,影响标记效果。

3. 室温搅拌时须避光,室内温度一般在 25℃ 为宜。标记物每次透析前,须认真检查,防止漏液。

4. 浓的标记物相当稳定,常加入 30~40% 甘油于-10℃ 下保存。4℃ 可保存 1~2 年,但稀释成1∶10,只能保存数周。已配制的使用液应在 12 小时内用完。切忌反复冻融。

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