CatchPoint cAMP荧光检测试剂盒应用方案解析
介绍
本研究展示了如何在 SpectraMax® i3多功能酶标仪中应用CatchPoint® cAMP荧光试剂盒监测腺苷酸环化酶激活剂forskolin对HEK293细胞的影响(如图1)。
G蛋白偶联受体(GPCRs)是重要的跨膜蛋白，能将胞外信号传导入胞内，引起信号逐级放大的级联反应，导致胞内某些蛋白活性或表达的改变[1]。3’, 5’-单磷酸化环腺苷(cAMP)作为第二信使参与GPCR活化后的下游反应。当胞外配体作用于GPCR时，GPCR构象发生改变，激活胞内连接的G蛋白。接下来的信号传导路径与被激活的G蛋白类型有关。其中当Gs蛋白被激活时，会导致腺苷酸环化酶活化引起的胞内cAMP浓度上调，进一步激活蛋白激酶A，最终促进一些目标蛋白的磷酸化，这些目标蛋白可能参与了例如多巴胺神经信号传导、葡萄糖再生反应、血管扩张、细胞有丝分裂、卵子成熟等重要生理生化过程[2-6]。
CatchPoint® cAMP荧光检测试剂盒采用免疫竞争原理测得cAMP浓度(如图2)，仅需一步洗脱，且反应底物加入后短可放置10分钟，长可延至24小时后再检测，信号稳定灵敏。
优势
• 通过检测cAMP浓度准确衡量GPCR活性
• 只需一步洗脱
• 信号稳定(10分钟-24小时)
• Z 因子为0.91
材料
· CatchPoint cAMP荧光检测试剂盒(Molecular Devices ，货号R8088)
· HEK293细胞 (ATCC 编号CRL-1573)
· KRGB缓冲液 (Sigma，货号K4002)
· 碳酸氢钠 (Sigma，货号S5761)
· PBS缓冲液 (Life Technologies，货号10010)
· 磷酸二酯酶抑制剂，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，
· IBMX (Sigma，货号17018)
· 30%过氧化氢溶液
· MEM培养基 (Corning，货号10-010)
· 胎牛血清 (Gemini Bio-Products，货号100-106)
· 青霉素 (Life Technologies，货号15070-063)
· Forskolin (Sigma，货号F6886)
· 多聚-D-赖氨酸包被96孔板 (Corning，货号354413)
· SpectraMax® i3多功能酶标仪
· SpectraMax® MiniMax™ 300细胞成像系统
· MultiWash+™ 洗板机
方法
H E K 2 9 3 细胞培养于全生长培养基(MEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素)中， 铺满T 75培养瓶瓶底8 0 - 9 0 %。0.05%胰酶消化后收集细胞，按照25000个/孔的密度接种到96孔板中(多聚-D-赖氨酸包被，黑壁底透)，接种密度可在25000-100000 个/ 孔范围， 3 7 ℃、5%CO2环境下细胞贴壁培养至少18h。
荧光检测前，先用SpectraMax® MiniMax™300细胞成像系统透射光通道观察细胞，以掌握其生长饱和情况，并应用Stain-Free™无标记细胞计数法准确测量细胞数目或覆盖面积百分比(即饱和度)，以达到质量控制的目的(如图3)。细胞饱和度高且孔间差异小的行被挑选进行CatchPoint检测。室温下先用0.75mM IBMX预作用细胞10分钟，然后37°C下用系列浓度梯度的forskolin(起始孔浓度1000nM，其他孔按1:3依次稀释)处理细胞15分钟。药物处理后按照CatchPoint检测试剂盒说明书裂解各孔细胞。
接下来按照产品说明书进行操作检测。cAMP标准样品检测得到一条标准曲线，以确认试剂盒功能是否正常，并可通过该拟合方程式计算出细胞样品中cAMP浓度。过程中洗脱步骤使用MultiWash+洗板机。红色底物StopLight加入样品30分钟后用SpectraMax® i3多功能酶标仪读数。SoftMax® Pro软件执行所有数据采集、分析和曲线拟合功能，另外还在模板库中提供了专门的CatchPoint cAMP检测试剂盒预设模板。
结果
在药物刺激前需掌握细胞饱和度情况，该实验中采用了M i n i m a x 成像系统以及StainFree无标记技术检测各孔中细胞覆盖面积百分比(如图3)。根据检测结果，A行和C行因为不同孔间均一的细胞生长饱和度被选作待测样品行。各处理孔提取出细胞裂解后的样品进行检测。
图4和5分别显示了cAMP标准曲线和细胞样品药物浓度响应曲线，两条曲线均用4参数拟合。标准曲线得到EC50 =3.3 nM，该值与已发表数据一致[7]，其中Z因子为0.91。Forskolin浓度响应曲线测得EC50=2.3 nM，该值符合根据HEK293细胞贴壁情况推导的结论。
结论
CatchPoint® cAMP荧光检测试剂盒能通过测量cAMP浓度准确衡量GPCR活性，检测信号极稳定(可维持10分钟-24小时)，优异的Z因子值，应用酶标仪荧光强度功能进行CatchPoint cAMP检测成为高通量药物筛选的可靠选择。
参考文献
1. Zaccolo, Manuela. “cAMP signal transduction in the heart: understanding spatial control for the development of novel therapeutic strategies.” British Journal of Pharmacology 158.1 (2009): 50-60.
2. Hanoune, Jacques, and Nicole Defer. “Regulation and role of adenylyl cyclase isoforms.”
Annual Review of Pharmacology and Toxicology 41.1 (2001): 145-174.
3. Griendling, Kathy K., et al. “Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology.” Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 20.10 (2000): 2175-2183.
4. Kemp, Bruce E., et al. “Dealing with energy demand: the AMP-activated protein kinase.” Trends in Biochemical Sciences 24.1 (1999): 22-25.
5. Etgen, Anne M., Michael A. Ansonoff, and Arnulfo Quesada. “Mechanisms of ovarian steroid regulation of norepinephrine receptor-mediated signal transduction in the hypothalamus: implications for female reproductive physiology.” Hormones and Behavior 40.2 (2001): 169-177.
6. Chini, Eduardo N., et al. “Adrenomedullin suppresses mitogenesis in rat mesangial cells via cAMP pathway.” Biochemical and Biophysical Research Communications 215.3 (1995): 868-873.
7. Hesley, Jayne, Janet Daijo, and Anne T. Ferguson. “Stable, sensitive, fluorescence-based method for detecting cAMP.” BioTechniques 33.3 (2002): 692-694.